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产品名称

REPLI-g WTA Single Cell Kit 试剂盒

产品型号
REPLI-g WTA Single Cell Kit
所属分类
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产品描述

REPLI-g WTA Single Cell Kit 试剂盒

 

从单细胞起始的总RNA或mRNA全转录本扩增

  • 从单一细胞实现完整的转录本覆盖度
  • MDA技术可实现均一的WTA,序列偏差可以忽略不计
  • 针对新技术应用(包括NGS)优化
  • 总RNA或富集mRNA(ploy A +)RNA的扩增
  • 用于癌症和干细胞研究的新工具

 

 
REPLI-g WTA Single Cell Kit能够在单细胞转录本水平上对转录调控的影响进行可靠的研究,并允许从单细胞(1–1000个细胞)进行所有转录物的均一扩增。专用的缓冲液和试剂经过了独特的、可控的净化步骤以防止REPLI-g技术扩增污染的核酸。创新的裂解液可以有效地稳定细胞RNA,以确保所得到的RNA准确地反映体内基因的表达图谱。所有的酶促步骤已经过专门改进,使得用于cDNA准确扩增的RNA得到高效处理。而扩增步骤则采用创新的多重置换扩增(MDA)技术,序列偏差可以忽略不计。
 
性能
覆盖全转录组,实验可重复性高
REPLI-g WTA Single Cell Kit包含新颖的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶,以及从1–1000个细胞或等量的小量样本进行全转录本扩增(WTA)的优化缓冲液和试剂。高效裂解细胞、彻底清除基因组DNA(gDNA)和敏感的逆转录物之后,采用多重置换扩增(MDA)技术,以可以忽略的序列偏差对整个转录本均一地扩增cDNA。使用REPLI-g WTA Single Cell Kit扩增的cDNA,经证明在二代测序技术(NGS)和real-time PCR应用中具有各细胞间和各次实验间的高度可重复性。扩增的cDNA可以轻松地应用于各种下游应用。
 
蛋白编码RNA的数量多
扩增富集mRNA的RNA (poly A+)的能力,使REPLI-g WTA Single Cell Kit特别适用于通过NGS研究单细胞转录本水平上的转录调控影响。产生超过90%的NGS片段的核糖体RNA(rRNA)扩增几乎完全被消除,可产生有意义的mRNA-Seq数据。使用mRNA富集实验方法的WTA后,80%以上的读段可以用于定位蛋白编码RNA。
 
可靠检测低丰度转录本
单细胞分析的挑战性大,尤其是同一细胞内的转录本丰度差异很大时。为获得准确的结果,应确保全转录组扩增时可靠扩增所有转录本。REPLI-g WTA Single Cell Kit高度适合于但细胞中转录本分析,即便是低丰度转录本。对使用REPLI-g技术扩增的转录本abl-1进行real-time PCR分析,结果显示即便是低丰度转录本也能在使用该试剂盒扩增后,得以可靠的检测。
 
多种研究领域的应用
REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从单细胞(如肿瘤细胞、干细胞或分选细胞)有效地扩增获得cDNA,并从纯化的总RNA或poly A+ RNA(10 pg–100 ng)生成和扩增cDNA,适合于广泛的研究领域(参见下表)。
 
样本类型和研究领域
样本材料(细胞/总RNA) 研究领域
人类/动物 生物标记物的研究(表达)
干细胞研究
游离胚胎细胞分析
嵌合体研究
遗传易感性研究
转基因动物基因分型
癌症 体细胞遗传变异分析
肿瘤恶化
肿瘤干细胞/演化
游离肿瘤细胞分析
原理
转录调节受到各种因素驱动,如应激、细胞环境或由疾病或体细胞基因组变异(例如,点突变、拷贝数变异或结构变化)等。此外,如可变剪接等转录后加工,导致转录模式不同并最终造成生理机能的不同。由于组织的复合结构,在单细胞中对转录调控进行研究,而不是分析大量的细胞并且立足分析结果解释他们的行为,正不断引起科学家们的兴趣。

REPLI-g WTA Single Cell Kit经过特别设计,能在单细胞转录水平上可靠地研究转录调节的影响。它可以对整个转录本进行高度均一的扩增,并且序列偏差可以忽略不计。REPLI‑g WTA Single Cell Kit提供的单细胞全转录本扩增是对全基因组扩增试剂(REPLI-g Single Cell Kit)的相应补充。本方法基于MDA技术,该技术利用能够复制可达70 kb而无需解离cDNA模板的一种独特的、连续性DNA聚合酶进行cDNA恒温扩增。
REPLI-g WTA Single Cell Kit独特的构成
  • 所有的试剂酶和扩增组分都经过了独特的、可控的净化步骤以确保消除被REPLI-g方法扩增的DNA或RNA污染。下面的步骤则是对试剂进行严格的质量控制,以确保其具有完整的功能。
  • 独特的裂解缓冲液可以有效地稳定细胞RNA和DNA。这确保了所产生的RNA能准确地反映体内基因表达图谱,以及RNA和DNA保持完整无缺,用于随后的基因组覆盖范围最大化分析。
  • 所有的酶促步骤已经过专门改进,使RNA或DNA的扩增准确而有效。例如,这些步骤包括在用于RNA扩增的cDNA合成之前有效的去除gDNA以及确保DNA有效扩增的酶解DNA制备。
  • 新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase可以用于多重置换扩增(MDA)。它是新开发的高亲和力酶,可以更有效地结合DNA,特别是当DNA浓度在反应混合物中较低时。此外,对比基于PCR的方法,REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase具有较强的校对活性,可以将错误减少1000倍。它还具有链置换活性,通过稳定的发夹结构使DNA得以复制,该结构对以Taq酶为基础的全基因组和全转录扩增步骤具有抗性。
流程
基因分析往往需要的cDNA。全转录本扩增克服了RNA数量少,可以对小数量的细胞甚至单个细胞进行分析。简单的反应设置,简单的反应设置,合理而简单的处理步骤,处理时间只需20分钟,完整的gDNA和RNA平行扩增总反应时间只有4小时,这使得REPLI-g Cell WGA & WTA Kit的操作步骤变得简单和可靠。 

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含用于以下反应的试剂:
  • 细胞裂解:单一细胞样品(含有1-1000个细胞)在5分钟内有效地裂解,对RNA的完整性没有影响。裂解的样品用于总RNA的WTA,或可选的,富集mRNA(poly A+)RNA。
  • cDNA生产:细胞裂解后,在进行WTA前将gDNA去除,这是由于转录水平的精确测量依赖于消除gDNA污染所造成的假阳性结果。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物,所有的转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集)或只有多聚腺苷酸转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ 富集mRNA)将会被扩增。因此,该反应将包含一个随机引物和寡核苷酸dT引物的混合物或只有寡核苷酸dT引物,这就减少了rRNA的扩增,并确保cDNA的3'末端反转录(转录物的大小大约是700–1000bp)。
  • 连接反应:合成的cDNA通过一个高效率的连接反应进行连接。由于该连接反应的性质,cDNA片段并未按照它们原本存在于细胞中的顺序组装。然而,这并不影响核酸序列的检测,如剪接区域,在下游应用中的进行NGS或qPCR。
  • 全转录本扩增:连接的cDNA随后被扩增,利用MDA技术与新颖REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase,等温反应2小时。
根据研究需要,我们针对从单细胞扩增cDNA或纯化RNA提供了不同的实验方案: 
  • “从单细胞扩增mRNA(poly A+)3'端区域”实验方案只扩增带有poly A +尾巴的mRNA(和其他的RNA),适合于广泛的应用,包括NGS(RNA-Seq)、real-time PCR和微阵列分析。
  • “从单细胞扩增总RNA”实验方案可扩增完整的转录本,包括带有和不带有poly A +尾的RNA,lnc RNA和linc RNA。需要注意的是,rRNA也将扩增并且扩增程度很高。如果用序列特异性探针(例如用qPCR或阵列协同工作),扩增的rRNA并不会影响下游应用的结果。如果将扩增的RNA用于RNA-Seq,请注意超过90%的片段来自于rRNA,因此进行全转录本测序时必须获得充足的读段。
  • “纯化RNA的扩增”实验方案针对从总RNA或富集RNA模板进行全转录本扩增的情况而优化,非常适合于规模性应用,包括NGS、real-time PCR和微阵列分析。
应用
REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从非常小量的样本均一地扩增全部的转录物,以非常有限或甚至可忽略地偏差扩增,准确呈递单细胞的转录模式。根据实验方法,扩增的cDNA非常适用于二代测序(RNA-Seq)、基因表达芯片或qPCR应用。
REPLI-g WTA Single Cell Kit可用于全转录本扩增的分析:
  • 带poly A+尾巴的mRNA
  • 总RNA
  • RNA转录组的所有区域
  • mRNA的3'末端
  • Lnc和Linc RNA
其不适合用于与小量核酸等一起使用:
  • tRNA和miRNA

 

 

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